XerumFree™用于最佳無血清細胞培養的*定義的添加劑。

XerumFree™ 被開發用于添加到基礎細胞培養基中以替代胎牛血清。它*不含動物和人類衍生的化合物。

當質量和一致性很重要時，XerumFree™ 是一個好的選擇。

tncbio XerumFree說明書

XerumFree易于使用：

只需像使用FBS（通常為10%）一樣將XerumFree添加到培養基中即可。要從含FBS的培養基轉變為含XerumFree的培養基，我們建議按照使用手冊（可根據要求提供，或從我們的網站下載）中所述的步驟進行細胞斷奶

在無干燥濃縮培養基上成功培養的細胞示例：

•肝上皮細胞•HaCaT

•原代人肝細胞•雜交瘤

•維羅•HEK293

•CHO•HEP G2

•HeLa•等。

•人類角質形成細胞

Catalog number      Volume                  Product

XF212-0100           100 ml                    XerumFree

XF212-0500           500 ml                    XerumFree

XF212-xxxx           on request / customized XerumFree

defined cellculture

XerumFree™ XF212 Medium Supplement.

完整定義、無動物成分的細胞培養補充劑。

在沒有血清的情況下進行細胞培養可能很有挑戰性。然而，這些回報在很大程度上是對這些努力的回報，重新發現細胞培養的基礎很快發展成為一種激情。本文的目的是引導用戶順利過渡到無血清狀態，并避免所有不充分或不適當的努力。

理想情況下，向無血清條件的轉化應進行多次傳代，以逐漸選擇可在無血清條件下生長的細胞。然而，如果所有關鍵方面都得到適當解決，直接適應無血清環境也可能成功。

無論采用何種方法，關鍵問題包括細胞接種物的生長狀態、細胞接種密度、亞培養技術和細胞培養系統的生物物理屬性。

TNCbio的XerumFree™ 血清替代物的設計目的是以與傳統細胞培養血清相同的方式使用，作為培養基補充。

使用濃縮防靜電劑前的重要注意事項™ XF212：

-XF212是一種替代血清的細胞培養基添加劑，因此它不是

最后一道菜。

-XF212必須添加到基礎細胞培養基中（例如IMDM、DMEM-F12或任何其他選擇的基礎培養基）。

-XF212不含細胞因子、激素等生長因子。

因此也沒有胰島素*。

內容：

1準備

1.1細胞培養基的一般制備

1.2無血清條件下的一般適應方法

1.2.1直接適應

1.2.2順序適應

2使用XF212

2.1細胞系

2.1.1錨定依賴性細胞系

2.1.2非錨定細胞系

1. 準備XF212

   1.1無血清細胞的一般制備

   培養基

   輕輕搖動免靜電瓶™ 使用前不久。

   添加XerumFree™ 與血清濃度相同的基礎培養基（例如10%）。

   在這個階段不要添加任何抗生素。事實上，抗生素和許多化合物一樣，與血清的血漿蛋白結合，尤其是與白蛋白部分結合。

   因此，在無血清和無白蛋白的條件下，相同濃度的抗生素將表現出更高的生物活性，這種活性的增加可能會對細胞生長產生有害影響。

   如果認為“無抗生素培養”不可行，建議使用濃度為50 mg/l的慶大霉素。

   *一些用戶更喜歡或需要在沒有胰島素的情況下培養細胞。如果是無靜電的™ 是否使用胰島素（和/或其他生長因子）培養細胞的決定權在你。如果細胞生長和性能需要胰島素，我們建議在1.25 mg/l的最終細胞培養基中添加重組胰島素。

    

1.2無血清條件下的一般適應方法

基本上有兩種方法可以使細胞適應無血清環境中的生長：

1.2.1直接適應

這是通過將細胞從含血清培養基直接轉移到無血清培養基來實現的。

1.2.2順序適應或斷奶方法將細胞從含有原始血清的培養基中依次通過以下階段，其中每個步驟將添加血清的培養基減半，從而將無血清培養基增加至大約低于以下值：

第一階段：

50%無干補充培養基/50%血清補充培養基

第二階段：

75%無干燥補充培養基/25%血清補充培養基

第三階段：

87.5%無干補充培養基/12.5%血清補充培養基

第四階段：

93.75%無干補充培養基/6.25%血清補充培養基

第五階段：

96.88%無干補充培養基/3.12%血清補充培養基

第6階段：

98.44%無干補充培養基/1.56%血清補充培養基

第7階段：

無干燥補充培養基

如果增長率下降，后退一步，在再次增長后繼續。

細胞培養可能包括細胞系（貼壁或懸浮生長）或原代培養。此外，從功能的角度來看，細胞類型可能會發生不同程度的分化，或者表現出未分化的特征，比如干細胞制劑。

在每種情況下，適應協議都必須考慮到細胞類型的特定要求，以確保獲得最佳成功機會。

2.XF212的使用

2.1細胞系

以下協議適用于正常（二倍體，有限壽命）或轉化或永生化細胞系（生命周期不確定）。

2.1.1錨定依賴性細胞系

關鍵成功因素：

-細胞培養載體的涂層可實現最佳細胞附著

-盡量減少胰蛋白酶的作用

-抗生素系統的選擇

實驗步驟：

A） 使用以下方法在細胞培養表面涂抹足夠的細胞附著因子：

-一種商用涂層試劑盒，如Pronectin™ F、 MapTRIX™ 或同等標準。

-纖維連接蛋白或聚賴氨酸涂層，或

-少量FBS（例如，T25燒瓶為500μl），在37°C下培養過夜，然后用PBS或新鮮培養基洗滌兩次。

-即用塑料可改善粘附細胞的附著。

B） 分離細胞單層

-在缺乏含有胰蛋白酶抑制劑的血清的情況下，標準胰蛋白酶制劑的使用可能會出現一些問題。它是

因此，在無血清條件下盡可能降低殘余胰蛋白酶的蛋白水解活性，以避免對細胞造成不可逆的損傷是非常重要的。

這可以通過使用胰蛋白酶抑制劑（例如來自大豆）或使用非哺乳動物解離試劑（例如

Accutase™ 在傳代過程中不需要滅活或去除。或者，細胞顆粒的額外洗滌步驟將去除大部分剩余的胰蛋白酶。然而，這個過程意味著額外的離心步驟，可能會對某些細胞類型造成損害。

-我們的偏好是：*忘記胰蛋白酶，使用Accutase™ 還是脫附™ 分離細胞單層；這些細胞分離解決方案

能夠滿足貼壁細胞溫和有效分離的苛刻

要求；細胞膜和表面表位不會受到損害，細胞的結構和功能質量也不會受到影響

表面蛋白質保持完整。

C） 每平方厘米20000個細胞的種子細胞

在根據第1點制備的完整培養基中。

-在試驗的第一步，觀察高播種密度是很重要的

適應過程。細胞通常分泌一系列因子

進入控制細胞附著、生長和增殖的培養基。然而，在播種階段，這些因素在土壤中是不存在的

新鮮無血清培養基和臨界水平的細胞密度對于誘導這些自分泌/旁分泌因子的立即充分產生至關重要。

D） 在37°C下培養并保持細胞培養物，直到它們達到80-90%的融合率。

-在此期間，每2-3天更換75%的培養基。不要丟棄用過的培養基。

取而代之的是收集條件培養基、無菌過濾器，并在4°C下放置，以便在接下來的步驟中使用。如果細胞在任何時候似乎停滯了，讓它們有更多的時間適應新的無血清環境。

E） 當達到接近融合時，以1:2或1:3的比例分裂細胞。

-這是XerumFree中的第二段™ 不需要涂層，但強烈建議使用條件培養基-該培養基部分確實包含調節附著、擴散、生長和生長的自分泌因子

激增在前一代收集的由75%新鮮培養基+25%條件培養基組成的混合物中的種子細胞。

繼續每2-3天向細胞提供75%的新鮮培養基，并按照上述d）收集條件培養基。

F） 重復步驟E），直到細胞表現出與之前在補充血清的培養基中的生長相當的生長動力學。

-在這一點上，細胞系可以被認為是*適應的。這可能總共需要4-6段。

G） 從這一點開始，抗生素可以添加到培養基中。

-我們建議使用廣譜抗生素慶大霉素；與標準抗生素相比，這種抗生素的細胞毒性大大降低

青霉素/鏈霉素雞尾酒。慶大霉素的建議使用濃度為50 mg/l。

H） 一旦調整，可以應用原始分割比率（在補充血清的條件下）。

2.1.2非錨定細胞系

以下方案適用于已經懸浮生長的細胞系。用于貼壁細胞對無干細胞的適應™ 懸浮生長，請參閱TNC BIO的技術說明“細胞從單層到無血清懸浮培養的適應性”。

關鍵成功因素：

抗生素系統的選擇

實驗步驟

A） 當細胞密度達到3-5 x 106個細胞/毫升（取決于細胞系）時，開始切換到無干燥狀態™ 補充中等。

收獲細胞懸浮液，取出一小份進行細胞計數，并以200 g離心整個懸浮液5分鐘。

B） 進行細胞計數。

C） 將細胞顆粒重新放置在無干燥的環境中™ 以106個細胞/毫升的密度補充培養基。

在適應過程的最初階段，觀察高播種密度很重要。

細胞通常會向培養基中分泌一系列因子來控制細胞的生長和增殖。然而，在播種階段，這些因素在新鮮無血清培養基中不存在，細胞密度的臨界水平是

對于誘導這些自分泌/旁分泌因子的立即充分產生至關重要。

D） 在37°C下培養并保持細胞培養物，直到其密度達到約3-5 x 106個細胞/毫升。

E） 以1:3或1:4的比例拆分懸浮培養物，方法是添加適當體積的新鮮培養基（例如，25毫升細胞懸浮液+75毫升無水培養基）™ 補充培養基，放入4個單獨的培養基中

船只）

F） 重復步驟E）直到培養物顯示出最初在補充血清的培養基中的生長動力學。從那時起，細胞系可以考慮

*適應，并可在補充血清培養期間按原始比例拆分。

G） 從這一點開始，抗生素可以添加到培養基中。

我們建議使用濃度為50毫克/升的慶大霉素；與標準的青霉素/鏈霉素雞尾酒相比，這種抗生素的細胞毒性要低得多。